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应用荧光分析技术检测蓝藻生物量的研究1

浏览次数:2073            发布日期:2008-07-21            作者:admin

应用荧光分析技术检测蓝藻生物量的研究
作者 陈纬栋
摘要

目前,水体富营养化引起藻华频繁爆发,寻求一种设备简单、操作方便、准确性高、价格低廉的蓝藻检测技术,实现藻类的实时、连续的原位监测,是水体富营养化预测预警的重要研究方向。
本课题研究应用荧光分析技术检测蓝藻生物量。通过对蓝藻中特征色素体藻蓝蛋白的荧光光谱的扫描,选用荧光激发波长630nm,荧光发射波长650nm,建立荧光检测藻蓝蛋白含量的方法。在铜绿微囊藻藻细胞浓度于105cell/mL-107cell/mL、钝顶螺旋藻藻细胞长度于

102mm/mL-105mm/mL的范围内,建立荧光检测关系,绘制藻蓝蛋白荧光强度对蓝藻生物量的工作曲线。改变蓝藻生长条件,研究不同生长条件的荧光检测关系,绘制不同光照强度下藻蓝蛋白荧光强度工作曲线簇,随着光照强度增大,工作曲线斜率降低,表明单位藻细胞中藻蓝蛋白的含量降低。根据蓝藻一个生命周期的生长曲线,研究不同生长阶段的荧光检测关系,绘制不同生长阶段中藻蓝蛋白荧光强度工作曲线簇,从迟缓期到生长期再到稳定期,工作曲线斜率先增大后减小,表明单位藻细胞中藻蓝蛋白的含量先增大后减小。在整个研究过程中,平行检测蓝藻细胞中的叶绿素a可见光吸光度作为对照比较实验。

关键词:荧光,藻蓝蛋白,蓝藻生物量
第1章 绪论
1.1 我国江河湖海现状
目前,我国大部分水库、湖泊均出现严重的富营养化现象,成为我国水源的一大威胁。

2005年的数据显示,40个被调查湖泊中有57.5%处于富营养或者超富营养状态,湖泊富营养化已经成为严重的中国环境问题[1 ]。据国家环保总局2006年中国环境状况公报显示,2006年,全国地表水总体水质属中度污染。在国家环境监测网(简称国控网)实际监测的745个地表水监测断面中(其中,河流断面593个,湖库点位152个),Ⅰ-Ⅲ类,Ⅳ、Ⅴ类,劣Ⅴ类水质的断面比例分别为40%、32%和28%(如图1-1),主要污染指标为高锰酸盐指数、氨氮和石油类等。
 
图1-1 2006年地表水断面水质类别比例
27个国控重点湖(库)中,满足Ⅱ类水质的湖(库)2个(占7%),Ⅲ类水质的湖(库)6个(占22%),Ⅳ类水质的湖(库)1个(占4%),Ⅴ类水质的湖(库)5个(占19%),劣Ⅴ类水质的湖(库)13个(占48%)。其中,巢湖水质为Ⅴ类,太湖和滇池为劣Ⅴ类。主要污染指标为总氮和总磷。
太湖湖体高锰酸盐指数、总磷年均值分别达到Ⅲ类、Ⅳ类水质标准,但因总氮污染严重,湖体水质为劣Ⅴ类,营养状态指数为63,处于中度富营养状态,与2005年相比,湖体水质无明显变化,在21个国控监测点位中,无Ⅰ-Ⅳ类水质,Ⅴ类和劣Ⅴ类水质点位分别占14%和86%。滇池湖体总体为劣Ⅴ类水质,主要污染指标为总磷、总氮和氨氮,草海处于重度富营养状态,营养状态指数为70;外海处于中度富营养状态,营养状态指数为77。与上年相比,外海水质变差。巢湖湖体水质总体为Ⅴ类,主要污染指标为总氮、总磷,与2005年相比,水质有所好转,处于中度富营养状态(其中,西半湖处于中度富营养状态,东半湖处于轻度富营养状态),营养状态指数为60(如图1-2)。
 
图1-2 2006年重点湖库营养状态指数
监测统计的5个城市内湖中,昆明湖(北京)为Ⅲ类水质,西湖(杭州)、东湖(武汉)、玄武湖(南京)、大明湖(济南)为劣Ⅴ类水质,主要污染指标是总氮、总磷;与2005年相比,昆明湖水质好转,玄武湖水质变差,其余城市内湖水质无明显变化;昆明湖为中营养状态,玄武湖、西湖、大明湖为轻度富营养状态,东湖为中度富营养状态,营养状态指数分别为44、56、56、58、65。
监测统计的10座大型水库中,石门水库(陕西)为Ⅱ类水质,丹江口水库(湖北)、密云水库(北京)、董铺水库(安徽)、千岛湖(浙江)为Ⅲ类水质,于桥水库(天津)、松花湖(吉林)为Ⅴ类水质,大伙房水库(辽宁)、崂山水库(山东)和门楼水库(山东)为劣Ⅴ类水质,主要污染指标为总氮;与上年相比,于桥水库水质由Ⅳ类变为Ⅴ类,水质变差,其它9座大型水库水质无明显变化;大伙房水库为中度富营养状态,密云水库为轻度富营养状态,其余7座大型水库均为中、贫营养状态。
全国近岸大部分海域水质良好,局部海域污染严重;远海海域水质良好。全国近岸海域一、二类海水比例为67.7%,三类海水为8.0%,四类、劣四类海水为24.3%;四大海区中,南海、黄海近岸海域水质良好,渤海近岸海域水质为轻度污染,东海近岸海域水质为中度污染[2]。
湖泊、水库、河流的富营养化不仅影响水体的功能,危害水生生物,破坏生态环境,加速水体的老化,还影响人类的生活供水。水生态系统中的富营养化污染越来越严重,其主要具体表现在大规模的藻华不断爆发,很多水库(包括一些作为饮用水水源的水库)在夏季都会受到蓝藻藻华爆发的影响。在水华发生时水体中含有大量有害藻类,COD和SS等指标亦急剧升高,导致给水厂滤池堵塞、产水量下降、出水浊度以及藻毒素含量超标等问题,严

重者将导致水厂被迫停产。水体富营养化所引发的藻华爆发,已严重危害到我国城市供水及生态环境和可持续发展,成为我国社会发展的一大障碍,其防治成为当前亟待解决的问题。

1.2 藻类和藻华
藻类,在现代植物学中,指无根、茎、叶的分化,个体发育中无胚胎时期,光合自养的一类低等植物。藻类是所有植物中最古老的。大多数藻类生活在水中。它们的结构非常简单,每个可见的个体都没有根、茎、叶的区别——是一个叶状体。我国学者一般将藻类分为

11门:蓝藻、红藻、隐藻、甲藻、金藻、黄藻、硅藻、褐藻、裸藻、绿藻、轮藻。

蓝藻是藻类生物,又叫蓝绿藻;大多数蓝藻的细胞壁外面有胶质衣,因此又叫粘藻。在所有藻类生物中,蓝藻是最简单、最原始的一种。所有的蓝藻都含有一种特殊的蓝色色素,蓝藻就是因此得名。但是蓝藻也不全是蓝色的,不同的蓝藻含有一些不同的色素,有的含有叶绿素,有的含有叶黄素,有的含有胡萝卜素,有的含有蓝藻藻蓝素,也有的含有蓝藻藻红素。红海就是由于水中含有大量藻红素的蓝藻,使海水呈现出红色。蓝藻在地球上大约出现在距今35-33亿年前,已知蓝藻约2000种,中国已有记录的约900种。分布十分广泛,遍及世界各地,但大多数(约75%)淡水产,少数海产;有些蓝藻可生活在60-85℃的温泉中;有些种类和菌、苔藓、蕨类和裸子植物共生;有些还可穿入钙质岩石或介壳中(如穿钙藻类)或土壤深层中(如土壤蓝藻)。蓝藻是单细胞生物,没有细胞核,但细胞中央含有核物质,通常呈颗粒状或网状,染色体和色素均匀的分布在细胞质中。该核物质没有核膜和核仁,但具有核的功能,故称其为原核。和细菌一样,蓝藻属于“原核生物”。它和具原核的细菌等一起,单立为原核生物界。蓝藻不具叶绿体、线粒体、高尔基体、内质网和液泡等细胞器,含叶绿素a,无叶绿素b,含数种叶黄素和胡萝卜素,还含有藻胆素(是藻红素、藻蓝素和别藻蓝素的总称)。一般说,凡含叶绿素a和藻蓝素量较大的,细胞大多呈蓝绿色。同样,也有少数种类含有较多的藻红素,藻体多呈红色。蓝藻虽无叶绿体,但在电镜下可见细胞质中有很多光合膜,叫类囊体,各种光合色素均附于其上,光合作用过程在此进行(如图1-3)[3]。在一些营养丰富的水体中,有些蓝藻常于夏季大量繁殖,并在水面形成一层蓝绿色而有腥臭味的浮沫,称为“水华”,大规模的蓝藻爆发,被称为“绿潮”(和海洋发生的赤潮对应)。绿潮引起水质恶化,严重时耗尽水中氧气而造成鱼类的死亡。更为严重的是,蓝藻中有些种类(如微囊藻)还会产生微囊藻毒素(简称MC),大约50%的绿潮中含有大量微囊藻毒素。微囊藻毒素除了直接对鱼类、人畜产生毒害之外,也是肝癌的重要诱因。微囊藻毒素耐热,不易被沸水分解,但可被活性碳吸收,所以可以用活性碳净水器对被污染水源进行净化。我国的《生活饮用水卫生标准GB5749-2006》中规定水质非常规指标MC-LR限值为1μg/L,世界卫生组织WHO1998年颁布的饮用水水质准则中也规定微囊藻毒素的限制标准为1μg/L。
 
图1-3蓝藻细胞结构模型图
1.鞘 2.细胞壁 3.藻胆体 4.类囊体 5.多磷酸体 6.核质 7.多面体 8.结构颗粒 9.糖原颗粒体 10.气泡
有害藻华(HAB,harmful algae bloom),是指在特定的环境条件下,水体中某些浮游植物、原生动物或细菌暴发性增殖或高度聚集而引起水体变色的一种有害生态现象。藻华(algal bloom)有时称水华或藻花,是指湖泊河流水体中藻类大量繁殖的一种现象,习惯上也将水体中藻类达到一定密度后的藻华称作赤潮(red tide)或红潮[4]。由于不同门类的藻类所含的光合作用色素不同,有害藻华随发生的原因、种类和数量而不同,引起的水色变化和在水面形成的漂浮物的颜色也有所不同,有红色或砖红色、绿色、黄色、棕色等。如微囊藻等一些蓝藻门的种类所含的光合色素为叶绿素a和藻胆素,它们形成的水华漂浮物和水的颜色多为蓝绿色;绿藻门中的衣藻所含的光合色素为叶绿素a和b,它所形成的水华漂浮物常为绿色或黄绿色;硅藻门中的藻类如小环藻等含有叶绿素a和c,还含有较多的墨角藻黄素等褐色素,它们形成的水华常为黄褐色等。水华水体中藻类可能有一种或数种,但优势种常为1-2种。水华形成的颜色就是由优势种的颜色所决定的[5]。值得指出的是,某些藻类(如膝沟藻、裸甲藻、梨甲藻等)引起的藻华有时并不引起水体变色。
近年来,随着经济的发展,人类活动范围的扩大,有毒有害藻华的发生次数日趋上升。

1878年Francis首次报道了动物由于引用含蓝藻的水而导致死亡的事件;1976年,美国宾夕法尼亚的Sewickley爆发了水源性消化道疾病,饮用水中的蓝藻被怀疑是致病原因。1996年巴西一透析中心,因透析液遭蓝藻污染,导致116名病人出现异常症状,并有26人死亡。近年来,由于引用或皮肤接触藻类污染水体而导致的皮肤反应、结膜炎、鼻炎、呕吐、腹泻及肠胃炎等事件也屡有发生。
蓝藻水华是淡水水体中危害最为严重的一种,蓝藻水华发生普遍、持续时间长,多数产毒危害性大。我国早在20世纪60年代就监测到太湖发生蓝藻水华,目前除了云南滇池、江苏太湖、安徽巢湖、武汉东湖和上海淀山湖等大型淡水湖泊已发生严重的蓝藻水华污染外,长江、黄河以及中下游的许多湖泊和水库中也相继发生了不同程度的蓝藻水华并监测到了藻毒素的存在[6]。
由淡水蓝藻水华引发的蓝藻毒素主要是细胞内毒素,当细胞破裂或藻类腐烂分解后,毒素才会被释放到水体中,人类在皮肤接触、饮用、食用水生动物等过程中可能会导致中毒。中毒症状一般表现为视力下降、呼吸急促、呕吐、腹泻等。目前,已经发现产生毒素的蓝藻有近40种,据蓝藻毒素对生理系统、器官、细胞等主要靶器官的不同影响,可将其分为肝毒素、神经毒素和接触、肠胃刺激性毒素(如表1-1)[7]。
表1-1 蓝藻毒素分类及产毒藻属

藻毒素

主要靶器官

产毒藻属

肝毒素

微囊藻毒素

肝脏

微囊藻,鱼腥藻,颤藻,念珠藻,软管藻,项圈藻

 

节球藻毒素

 

节球藻

 

筒胞藻毒素

 

筒胞藻,束丝藻,Umezakia

神经毒素

类毒素-a

神经

鱼腥藻,颤藻,束丝藻

 

拟类毒素

 

鱼腥藻

 

贝类毒素

 

鱼腥藻,束丝藻,稍丝藻,筒胞藻

接触、肠胃

刺激性毒素

脂多糖内毒素

皮肤、肠胃

蓝藻

2007年5月底6月初,太湖梅梁湾提前暴发了大规模藻类水华,梅梁湾所有测点的藻类叶绿素a含量全部超过40μg/L,其中鼋头褚三山水域藻类叶绿素a含量达到179μg/L,藻类水华在梅梁湾全湾暴发导致周围水域大面积水质恶化,严重影响居民生活和城市生产。据有关资料显示,因太湖整个水质污染造成的经济损失每年大约在50亿左右。
有害藻华的危害面积极大,影响因素众多,其研究涉及学科范围很广,属于“大环境”问题,美国、日本、中国、加拿大、法国、瑞典、挪威、菲律宾、印度、印度尼西亚、马来西亚、韩国、香港等30多个国家和地区水华灾害发生都很频繁。当前,有害藻华已经成为全球共同专注的严重自然灾害之一。

1.3 藻类的检测和藻华的防治
随着水生态系统中的富营养化污染越来越严重,很多水库(包括一些作为饮用水水源的水库)在夏季都会受到蓝藻藻华爆发的影响。大多数蓝藻会产生种类繁多的生化或有毒物质,所以它们在水源地和水处理厂的爆发会给人类和其他生物带来高度的健康威胁。为了保护人类免受蓝藻毒素的危害,对于水源地和水处理厂常采用检测浮游植物群落的方法。
常用的藻类的检测方法有:
(1)传统显微镜技术
检测水体或原水中浮游群落的传统方法——显微镜法已经被运用了很多年了,运用显微镜分析组成成分和细胞数量,能够在属种层面给予浮游植物群落详细的分析[8],这种方法已被标准化了,并且被常规的运用着,也已经成为了一些国家立法的一部分。

这类方法是利用特定的细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。此方法的缺点不能区分死菌与活菌。计数板是一块特制的载玻片,上面有一个特定的面积l mm2和高0.1mm的计数室,在1mm2的面积里又被刻划成25个(或16个)中格,每个中格进—步划分成16个(或25个)小格,整个计数室是由400个小格组成。
但是,血细胞计数板法很耗费时间,并且显微镜分析需要专业技术知识,在计数方面存在着显著的统计误差。
(2)测定叶绿素a含量
藻类中的叶绿素a是主要光合色素,它有两方面的作用。一方面,叶绿素a作为捕光色素,和蛋白结合形成叶绿素a蛋白复合体,捕获光能供给光合作用。叶绿素a在 450nm至650nm之间的吸收很弱,此区域属于绿光区,所以呈现绿色。叶绿素a在红光区和蓝光区各有一个吸收峰,可以作为其特征峰。另一方面,叶绿素a 还是所有高等植物和绝大多数藻类的光合作用的反应中心色素。在藻类细胞内,光系统Ⅰ(Photosystem Ⅰ)的反应中心是叶绿素a的二聚体,称为P700;光系统Ⅱ(Photosystem Ⅱ)的反应中心是一对叶绿素a,称为P680。
但是同样,测定叶绿素a含量很耗费时间。并且,原水的浮游植物群落中,并不仅仅只有蓝藻含有叶绿素a,其他藻类如绿藻、硅藻等均含有叶绿素a,所以测量叶绿素a的含量虽然可以用于藻类的检测,但是无法选择性的检测蓝藻的生物量,存在其局限性。
(3)荧光分析技术
由于上述原因,越来越多的人开始关注于一种灵敏而直接的测定蓝藻数量的方法,能够在短时间内把蓝藻从其他藻类中区分出来,进行选择性的检测。基于活体藻类的光合色素的研究方法已经被用来区分主要的浮游植物群落了[9]。
藻类的色素,是藻类进行光合作用时吸收、转化和传递光能的主要物质。叶绿索a是浮游植物的主要光合色素。其他辅助色素(如叶绿素b和c,类胡萝卜素和藻胆素)通过给有机体提供光能收集窗口,在光合作用中起着重要作用,并且在高生长辐射中阻止细胞破坏,提供光学保护作用。个别色素的存在或缺乏有助于辨别天然水体中的主要藻种。某些色素仅存在于某一藻种或者只存在于两三种藻种中的特性,可以用于浮游植物群落组成的定量评估。表1-2列出了主要色素和海洋浮游藻类的对应关系[10]。
 
表1-2主要色素与浮游藻类对应关系
  

色素

硅藻

甲藻

绿藻

原绿藻

青绿藻

金藻

定鞭金藻

隐藻

裸藻

蓝藻

叶绿素

叶绿素a

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

二乙烯基叶绿素a

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

叶绿素b

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

二乙烯基叶绿素b

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

叶绿素c1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

叶绿素c2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

叶绿素c3

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Mg38-二乙烯基菲欧卟啉

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

类胡萝卜素

别黄素

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

百合黄素

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

19-丁酰氧岩藻黄素

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

β,ε-胡萝卜素

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

β,β-胡萝卜素

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

β,γ-胡萝卜素

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

硅甲藻黄素

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

硅藻黄素

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

双鞭藻黄素

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

岩藻黄素

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

19’-乙酰氧岩藻黄素

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

叶黄素

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

蓝藻叶黄素

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

新甲藻黄素

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

多甲藻素

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

青绿黄素

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

管藻黄素

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

紫黄素

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

玉米黄素

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

藻胆素

藻蓝蛋白

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

藻红蛋白

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

别藻蓝蛋白

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


对于蓝藻而言,光合色素分为3类:叶绿素、类胡萝卜素和藻胆素。藻细胞中,藻胆素和蛋白体组成藻胆蛋白,藻胆蛋白聚合而成藻胆体。藻胆蛋白主要有3类:藻红蛋白(Phycoerythrin,PE)、藻蓝蛋白(Phycocyanin,PC)和别藻蓝蛋白(Allophycocyanin,APC)。藻胆蛋白的颜色是由它们所含的藻胆素决定的,蓝藻中主要含有4中藻胆素:蓝色的藻蓝素(Phycocyanobilin,PCB)、红色的藻红素(Phycoerythrobilin,PEB)、黄色的藻尿胆素(phycourobilin,PUB)、紫色的藻胆紫素(phycobiliviolin),也称隐藻紫素(Cryptoviolin,CV)[11]。
对于蓝藻而言,藻蓝蛋白是其特征色素体,能够用来进行荧光特性分析。虽然荧光分析法会受到一些外部因素的影响,如光照条件,营养盐浓度,细胞世代等,但荧光分析法仍然是检测浮游植物群落和选择性检测蓝藻生物量的实用方法[12]。这种简易的方法不仅被运用于生态学研究,而且被应用于原水或水处理厂饮用水分析,作为一种灵敏的早期选择性检测潜在蓝藻的方法。

1.4 分子荧光分析法
某些物质的分子吸收一定的能量跃迁到较高电子激发态后,在返回基态的过程中伴随有光辐射,这种现象称为分子发光。荧光是分子发光中的光致发光现象,是吸光受激分子处在不同类型的电子激发态时所产生的光辐射现象。利用物质的分子吸收光所产生的荧光对物质进行分析测定的方法,称为分子荧光分析法。荧光分析基本装置由电源、光源、激发单色器、样品池、发射单色器、检测器、信号放大器和打印系统组成。图1-4是荧光分光光度计基本工作原理图。由光源发出的一定强度的激发光经聚光镜、狭缝进入激发单色器分光,选择最佳波长的光去激发样品池内的荧光物质。该物质发出的荧光可射向四面八方,但通过样品池后的激发余光是沿直线传播的。所以,荧光检测器即光电倍增管(PMT)不能直接对着光源,一般放在样品池的一边,与激发光路程直角关系,否则,强烈的激发余光会透过样品池干扰荧光的测定,导致实验失败,甚至损坏PMT。荧光物质发生的荧光经发射单色器滤去样品池的反射光、溶剂的瑞利散射光、拉曼光以及溶液中杂质所产生的荧光等杂光的干扰,提高了测定的选择性,只让待测物质的特征荧光照射到检测器上进行信号转换,并经信号放大系统进行放大,由数据处理及显示、打印系统以适当的形式报告出来。
 
图1-4 荧光分光光度计基本工作原理
荧光激发光谱(fluorescence excitation spectrum)是激发光的波长连续变化,在某一固定荧光测定波长下测得的该物质荧光强度变化的图像。测定时,先固定发射单色器的波长,使测定的荧光波长保持不变,然后改变激发单色器的波长由400-700nm进行扫描,以显示系统测出的固定浓度的该物质的相对荧光强度为纵坐标,以相应的激发光波长为横坐标作图,所绘出的曲线即是该荧光物质的激发光谱。它反映了仪器条件一定时,激发光波长与荧光强度之间的关系,为荧光分析选择最佳激发光波长和鉴别荧光物质提供依据。
荧光发射光谱(fluorescence emission spectrum)是固定激发单色器波长,使激发光波长和强度保持不变,然后改变发射单色器波长依次进行各种不同波长扫描所获得的光谱,简称荧光光谱。它表示在该物质所发射的荧光中,各种不同波长组分的相对强度,为鉴别荧光物质、进行荧光分析、选择最佳测定波长提供依据[13]。

测定样品荧光强度时,需要根据荧光激发光谱选择最佳激发光波长,再根据荧光发射光谱选择最佳发射波长,然后在最佳激发波长和最佳发射波长的条件下,测定被测物质的荧光强度。

1.5 研究目的和意义
在藻类生物量检测方面,传统的藻类显微镜计数方法效率低,需要耗费大量的人力物力[14];对分析人员经验要求较高而且精度较低[15];由于不能进行原位检测,以及采样与得到结果之间的时间延迟使得这种方法失去了检测的意义和进行水华预警的优势[16]。荧光分析技术弥补了上述缺陷,仪器设备相对简单、操作简便,干扰因素少,可以实现藻类的实时、连续的原位监测,可为水华预警提供更为密集和精确的藻类监测数据。
本课题利用荧光分析技术检测蓝藻生物量。蓝藻的主要光合色素是叶绿素a和藻胆素,其中藻蓝蛋白是其特征色素体。采用纯培养的单种蓝藻,利用特征波长的激发光照射活体蓝藻悬液,通过检测特征波长的发射荧光来检测藻蓝蛋白的含量,从而测定蓝藻的生物量。理论上,不同形态特征的蓝藻,同种蓝藻的不同生理状态下,其光合色素的含量是不尽相同的,本课题选择单细胞蓝藻(铜绿微囊藻)和丝状蓝藻(钝顶螺旋藻),对不同生长速率下荧光特性与生物量之间的关系进行研究,建立典型蓝藻的生物量的荧光检测方法。
 
第2章 研究内容和方法
2.1 研究内容
(1)荧光检测方法的建立。包括对蓝藻和绿藻的荧光图谱的扫描分析,对最佳荧光激发波长和荧光发射波长的选择,以及与其他平行检测方法的比较研究。
(2)荧光检测关系的建立。包括不同形态蓝藻的荧光强度与其生物量对应关系的建立,以及与其他平行检测方法的比较研究。
(3)蓝藻不同生长条件的荧光检测关系的研究。主要研究不同光照强度下蓝藻生物量的荧光检测关系的变化情况。
(4)蓝藻不同生长阶段的荧光检测关系的研究。主要研究不同生长阶段中蓝藻生物量的荧光检测关系的变化情况。

2.2 实验材料
2.2.1 藻种
实验用铜绿微囊藻、钝顶螺旋藻和斜生栅藻取自中国科学院武汉水生生物研究所藻种库。
实验选用铜绿微囊藻的原因是铜绿微囊藻作为一种典型的蓝藻,属于蓝藻门微囊藻科,是最常见的一类淡水藻,也是江河湖海水体富营养化的优势种群,同时其所含的微囊藻毒素也是人们关注的焦点,所以选用铜绿微囊藻作为荧光检测的一个主要对象。
实验选用钝顶螺旋藻的原因是虽然钝顶螺旋藻也是一种蓝藻,但是它的形态特征与单细胞蓝藻铜绿微囊藻完全不同,它属于蓝藻门颤藻科,在显微镜下可见其形态为螺旋丝状,可以作为丝状蓝藻的典型代表来进行研究。螺旋藻虽是一类低等植物,但是人类迄今为止所发现的最优秀的纯天然蛋白质食品源,被联合国粮农组织和联合国世界食品协会推荐为二十一世纪最理想的食品,所以研究其荧光特性也有实际意义。
实验选用斜生栅藻的原因是斜生栅藻是一种绿藻,属于绿藻门栅藻科,在本课题中是用来作为蓝藻荧光特性的比对藻种进行研究的。斜生栅藻的个体大小清晰可辨,是国际上水体试验的标准藻种。栅藻是最常见的一类淡水藻,在世界各地的淡水水体中,甚至在土壤中都可发现它们,这说明这类生物对环境条件的耐受范围很广,易于生长,这也是选择它作为绿藻比对藻种的典型代表的原因。
2.2.2 接种
试验前将三种藻种扩大培养1周左右。取一定体积的藻液以3000r/min的速度离心15min,弃置上清液,用15mg/L的碳酸氢钠溶液洗涤后离心,重复3次,用无菌水稀释后,根据不同的浓度要求接种。
2.2.3 培养条件
铜绿微囊藻采用BG-11培养基培养,培养温度25℃,光照强度约为800-12000lx,光暗比14L:10D,倾斜静置培养,每日定时晃动1min。
BG-11培养基配方:硝酸钠(NaNO3)1.5g/L,碳酸钠(Na2CO3)20mg/L,磷酸氢二钾(K2HPO4)40mg/L,硫酸(MgSO4•7H2O)75mg/L,氯化钙(CaCl2•2H2O)36mg/L,柠檬酸6mg/L,柠檬酸铁铵6mg/L,乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)1mg/L,A5溶液(硼酸(H3BO3)2.86mg/L,氯化锰(MnCl2•4H2O)1.81mg/L,硫酸锌(ZnSO4•7H2O)0.22mg/L,钼酸钠(Na2MoO4•2H2O)0.039mg/L,硫酸铜(CuSO4•5H2O)0.079mg/L,硝酸钴(CoNO3•6H2O)0.049mg/L)。

BG-11是培养蓝藻使用最广泛的培养基,除了极少部分蓝藻,大部分都使用BG-11。按照配方配制好后高压灭菌,BG-11经常会产生絮状沉淀。这是因为其中有Ca2+和CO32-,我们可以灭菌后在超净台上用灭菌过的注射器来加两者之中的另外一种。建议将氯化钙的母液单独灭菌后在无菌室保存,在配制好BG-11的工作液并灭菌之后,在超净台上用注射器将氯化钙加入。
培养基用水:蒸馏水在立式压力蒸汽灭菌器中灭菌后备用。
钝顶螺旋藻采用AB培养基培养,培养温度25℃,光照强度约为800-12000lx,光暗比14L:10D,倾斜静置培养,每日定时晃动1min。
AB培养基的配方:碳酸氢钠(NaHCO3)13.61g/L, ,碳酸钠(Na2CO3)4.03g/L,磷酸氢二钾(K2HPO4)0.5g/L,硝酸钠(NaNO3)2.5g/L,硫酸钾(K2SO4)1g/L,氯化钠(NaCl)

1g/L,硫酸镁(MgSO4•7H2O)0.2g/L,氯化钙(CaCl2•2H2O)0.04g/L,A5溶液(A5 solution)1mL/L,PIV金属溶液(PIV mental solution)6mL/L,维生素B12(Vitamin B12)0.15μg/L。
其中A5溶液的配方:硼酸(H3BO3)2.86g/L,氯化锰(MnCl2•4H2O)1.81g/L,硫酸锌(ZnSO4•7H2O)0.22g/L,硫酸锰(MnSO4•7H2O)2.5g/L,硫酸铜(CuSO4•5H2O)0.074g/L,钼酸钠(Na2MoO4)0.021g/L。
其中PIV金属溶液的配方:乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)0.750g/L,氯化铁(FeCl3•6H2O)97mg/L,氯化锰(MnCl2•4H2O)41mg/L,氯化锌(ZnCl2)5mg/L,氯化钴(CoCl2•6H2O)2mg/L,钼酸钠(Na2MoO4•2H2O)4mg/L。
培养基用水:蒸馏水在立式压力蒸汽灭菌器中灭菌后备用。
斜生栅藻采用BG-11培养基培养,培养温度25℃,光照强度约为800-12000lx,光暗比14L:10D,倾斜静置培养,每日定时晃动1min。
BG-11培养基配方同铜绿微囊藻BG-11培养基配方。
培养基用水:蒸馏水在立式压力蒸汽灭菌器中灭菌后备用。

2.3 实验仪器
本课题所用仪器如表2-1所示:
表2-1 实验仪器

仪器名称

仪器型号

生产厂家

立式压力蒸汽灭菌器

YXQ-LS-50S1

井内盛荣堂株式会社

电子天平1

TD

余姚市金诺天平仪器有限公司

电子天平2

Shangping 2104s

上海精科天平

人工气候室

RSZ-2

宁波科技园区新江南仪器公司

数位式照度计

TES-1330A

泰仕电子工业股份有限公司

光学显微镜

Olympus BX51

奥林巴斯大学工业株式会社

血细胞计数板

XB-K-25

上海求精生化试剂仪器有限公司

10微升计数框

CC-PP

北京普力特仪器有限公司

石英自动双重纯水蒸馏器

1810-B

江苏省金坛市荣华仪器公司

超声波清洗器

KQ-250B

昆山市超声仪器有限公司

紫外可见分光光度计

UV-2102 PCS

尤尼柯(上海)仪器有限公司

荧光分光光度计

RF-5301PC

日本岛津公司

2.4 实验试剂
本课题所用试剂均为A.R.级,如表2-2所示:
表2-2 实验试剂

试剂名称

试剂规格

生产厂家

丙酮

分析纯

上海化学试剂有限公司

硝酸钠

分析纯

中国医药集团上海化学试剂公司

磷酸氢二钾

分析纯

中国医药集团上海化学试剂公司

硫酸镁

分析纯

中国医药集团上海化学试剂公司

氯化钙

分析纯

中国医药集团上海化学试剂公司

柠檬酸

分析纯

中国医药集团上海化学试剂公司

柠檬酸铁铵

分析纯

中国医药集团上海化学试剂公司

乙二胺四乙酸二钠

分析纯

中国医药集团上海化学试剂公司

碳酸钠

分析纯

上海化学试剂有限公司

氯化锰

分析纯

上海化学试剂有限公司

硫酸锌

分析纯

中国医药集团上海化学试剂公司

钼酸钠

分析纯

中国医药集团上海化学试剂公司

硫酸铜

分析纯

上海化学试剂有限公司

硝酸钴

分析纯

中国医药集团上海化学试剂公司

钼酸铵

分析纯

上海化学试剂有限公司

钼酸铵

分析纯

上海化学试剂有限公司

酒石酸锑钾

分析纯

上海化学试剂有限公司

硫酸

分析纯

中国医药集团上海化学试剂公司

硝酸钾

分析纯

上海化学试剂有限公司

碳酸氢钠

分析纯

上海化学试剂有限公司

抗坏血酸

分析纯

中国医药集团上海化学试剂公司

邻苯二甲酸氢钾

分析纯

中国医药集团上海化学试剂公司

重铬酸钾

分析纯

中国医药集团上海化学试剂公司

硫酸银

分析纯

中国医药集团上海化学试剂公司

2.5 测试方法
本课题各项指标测试方法如表2-3所示:
表2-3 测试方法

测试指标

测试方法

铜绿微囊藻细胞数量

血细胞计数板法

钝顶螺旋藻细胞长度

10微升计数框法

斜生栅藻细胞数量

血细胞计数板法

藻蓝蛋白含量

荧光分光光度法

叶绿素a含量

可见光分光光度法

光照强度

ZDS-10自动量程光照度计直接测定


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