荧光检测藻蓝蛋白—译文及原文3

浏览次数：1438            发布日期：2008-07-21            作者：admin

译文及原文
荧光检测藻蓝蛋白
作为水库进水口蓝藻在线早期预警系统

Katarzyna Izydorczyk，1 Malgorzata Tarczynska，2 Tomasz Jurczak，2 Jaroslaw Mrowczynski，2 Maciej Zalewski1
1国际生态中心，波兰科学院，3泰纳街，90-348罗兹，波兰
2应用生态学院，罗兹大学，巴纳察12/16，90-237罗兹，波兰

2005年1月26日收到；2005年3月28日修订；2005年3月30日接收

摘要

饮用水水库中的蓝藻赤潮，可能会导致不同的水质问题，包括它们的味道和气味，并且注定会危害饮用水供给。作为对这个问题的回应，一个在进水口分析蓝藻浓度的在线监测工具是有一定的实用价值的。本研究在低地的饮用水水库，利用在线检测显示铜绿微囊藻爆发期间，藻蓝蛋白的荧光强度和蓝藻生物量呈正相关性。最高的相关系数位于蓝藻生物量浓度低15毫克鲜重/升，这表明这种方法可以作为一种有效的预警系统。风漂移使更高的蓝藻浓度进入进水口时，荧光强度急剧变化，这表明荧光可被应用于动态植物活动的快速预警。?2005年出版社，期刊，公司，环境毒物20：425-430，2005。

关键词：微囊藻；藻蓝蛋白；荧光；微囊藻毒素；饮用水水质

 

绪论

饮用水水库的蓝藻赤潮是当前水处理工艺的重大挑战，如果有毒素存在，则构成了消费者健康的潜在危险（Falconer，1994年，2005年；Codd，2000年；Mankiewicz等人，2003年）。微囊藻及其他蓝藻属所产生的微囊藻毒素，是可能的致癌物质，有肿瘤促进作用，并会导致原发性肝癌（Carmichael，1992年；Fujiki等人，1996年）。Falconer等人（1988年），Carmichael和Falconer（1993年），Codd等人（1997年）已经报道过因摄食水或含毒素的细胞而中毒和死亡的家畜和野生动物。世界卫生组织（WHO）建议的饮水中最高浓度微囊藻毒素是1微克/升（Chorus和Bartram，1999年），波兰自2002年以来也已经通过了这项立法（卫生管理部门，2002年）。
因为传统的饮用水处理过程中没有充分有效的去除味道，气味和毒素，人类会曝露在这些有害物质中。因此，重要的是在原水中要有一个有效率的蓝藻预警系统，可以提供快速的信息用于水处理。
Bartram等人（1999年）为蓝藻提出了一项警戒级别的框架，为水处理厂的运作和管理提供了监测和管理的顺序。它是基于蓝藻细胞计数和叶绿素a浓度的。不幸的是，这些方法不适合在线监测。在测量蓝藻特征色素的光子发射量的基础上，荧光测量藻蓝蛋白是一个非常灵敏的方法（Rohacek和Bartak，1999年；Maxwell和Johnson，2000年）。它不需要预处理水样本，可以提供快速的结果。
一个公认的最好的荧光测量应用实例是研究叶绿素a浓度（Pinto等人，2001年）。不过，叶绿素a含量的测量，并不区分真核浮游植物和蓝藻，这对于在混合浮游植物组合中选择性的检测蓝藻尤为重要。混合浮游植物组合中藻蓝蛋白含量是表示水样中蓝藻含量的一个非常有用的指标（Watras和Baker，1988年；Otsuki等人，1994年；Lee等人，1995年；Hashimoto和Otsuki，1995年；Hashimoto等人，1997年；Ahn等人，2002年；Vincent等人，2004年）。
本文报导运用藻蓝蛋白荧光技术在饮用水进水口在线检测蓝藻。分析了在低地水库微囊藻华爆发期间，藻蓝蛋白荧光强度，蓝藻生物量和微囊藻毒素浓度之间的关系。
 

材料和方法

在皮里卡河流域的素勒舟水库，是该地区的城市和一个游乐区的主要饮用水源。水库富营养化，平均总磷浓度约0.38毫克/升（Wagner和Zalewski，2000年）。叶绿素浓度在生长季节，平均值达到30毫克/立方米，在浮游植物爆发期间可以超过100毫克/立方米。蓝藻中优势种是铜绿微囊藻。分析蓝藻藻华样本证实，它们具有极强的肝毒特性（Tarczynska等人，2001年；Jurczak等人，2004年）。
在水库中央部分一个狭窄的分隔区的尽头，是素勒舟–罗兹饮用水供水区的进水口，应用荧光在线检测作为一个早期预警系统调查这里。
荧光测量原水中的藻蓝蛋白，采用了10-AU-005型特纳荧光仪和藻蓝蛋白光学套件（P/N：10-305），其中包括一个冷白色汞蒸气灯，一个630纳米激发过滤器，一个660纳米发射过滤器。该荧光设置为连续流动模式。水流通过一个25毫米区域。最低检测水平约为1000细胞/毫升。测量从2002年8月至2002年9月和从2003年5月至2003年9月，期间用一台数据记录仪每隔15分钟收集一次数据。
在同一时期，每周收集两次水质样本进行物理，化学和生物分析。在实验室里水样中浮游植物的估计被保存在卢卡斯试剂并沉积。浮游植物计数使用Fusch-Rosenthal计数细胞。在运用几何近似进行细胞体积分析的基础上，确定浮游植物的生物量（鲜重）。生物量的计量从以体积单位换算成以鲜重（FM）为单位，假设体积的一个单位（=1）是某一浮游植物鲜重的一个单位（Komarkowa等人，1995年）。
微囊藻毒素的分析有两种形式：溶解于水中和束缚于悬浮物中。用悬浮物分析，水样通过一个Whatmann GF/C 0.45微米的过滤器过滤，立即冻结在-20℃。微囊藻毒素从悬浮物质中提取在75％甲醇水溶液中。样品在Misonix（Farmingdale，NY，美国）超声波仪、超声波探头（100瓦特，直径19毫米，有一“尖头”）和液体处理器XL中超声波震荡30秒。提取物在Eppendorf 5804离心机（德国）中4℃的温度下以11000克离心10分钟，离心两次。收集上清液在SC110A Speedvac Plus（Thermo Savant，Holbrook，NY，美国）中蒸发。在高效液相色谱分析样品之前，样品析出在一毫升75％的甲醇水溶液中，过滤通过装有0.45微米的GHP膜和尖头插座（德国）的Gelman GHP Acrodisc 13毫米口径的注射过滤器。溶解微囊藻毒素的1升过滤水样集中于Baker（荷兰）的固相萃取（SPE）系统，用90％甲醇水溶液与0.1％三氟乙酸（黄蜀葵总黄酮）从C18色谱柱洗脱。甲醇被蒸发，样品析出在一毫升75％的甲醇水溶液中，准备高效液相色谱分析。
测定微囊藻毒素的高效液相色谱-二极管阵列法，采用水-三氟乙酸-乙腈梯度做流动相，C18做固定相，在200-300纳米二极管阵列检测。样品分析使用了一个高性能的液相色谱仪配备梯度泵，自动进样器，柱式加热炉，和Agilent科技（Waldbronn，德国）的光电二极管阵列（PDA）探测器（Agilent 1100系列）。固定相是Purospher STAR RP-18柱LiChroCART（55×4毫米标识；3微米）。该柱由一名警卫柱保护。流动相由线性梯度溶剂A（水与0.05％三氟乙酸）和溶剂B（乙腈与0.05％三氟乙酸）组成：25％B用0分钟，70％B用5分钟，70％B用6分钟，25％B用6.1分钟。注射量20微升，流速1毫升/分钟，柱温40℃。在蓝藻提取物中的微囊藻毒素，通过它们的特征吸收光谱和保留时间，对照微囊藻毒素的标准，确定了是MC-LR，MC-RR，和MC-YR。
 

结论

2002年夏季，素勒舟水库浮游植物群落以蓝藻为主（98％），主要是铜绿微囊藻，也有双鞭藻，惠氏微囊藻，水华束丝藻和假鱼腥藻。观察蓝藻最高生物量，在8月中旬，达至50毫克/升（图1）。2003年期间浮游植物生物量较低。在春季浮游植物群落以硅藻为主，如扭曲小环藻，微星鼓藻，钝脆杆藻，矽藻和美丽星杆藻，硅藻的最大生物量为15毫克/升。在夏季以蓝藻（铜绿微囊藻）为主，最大生物量的峰值为10毫克/升。种类繁多的隐藻（马索隐藻，卵形隐藻，Platyuris隐藻）和绿藻（衣藻，栅藻，S. bicaudatum绿藻，短棘盘星藻）是微不足道。

 

2002年暑假藻华爆发期间，两次观察到最高浓度的微囊藻毒素超过7微克/升（图2）。八月微囊藻毒素溶解于水中的浓度高于在细胞中的浓度。这个比例在9月发生变化。2003年，微囊藻毒素的浓度低，在0.0和0.5微克/升之间波动，其中只有两个浓度高于1微克/升。

 

以100为相对单位（原始）的最高强度藻蓝蛋白荧光值，是2002年夏季蓝藻爆发的时候（图1和2）。荧光强度八月底下降了，原始值在1.5和11.6之间振荡。2003年，藻蓝蛋白的荧光强度原始值在0.2和13.4之间振荡。
应用连续流动模型的荧光检测方法，每天观察原水中藻蓝蛋白荧光强度的变化（图3）。荧光原始值2小时内从18增至75是强风扰动进水口附近的蓝藻聚集的结果。前一天稳定的天气状况致使一直保持着平稳而较低的荧光强度。

 

研究表明，蓝藻生物量低于15毫克/升时，藻蓝蛋白的荧光强度和蓝藻的生物量呈正相关关系（r=0.65，n=32，p<0.05）[图4（A）]，浮游植物以具有肝毒性的铜绿微囊藻为主。生物量超过15毫克/升的荧光值不包括在相关性分析内，因为该藻华爆发的天数在统计上微不足道。
研究还表明，微囊藻毒素总浓度低于3微克/升时，藻蓝蛋白荧光强度和微囊藻毒素总浓度的呈中等程度的相关性关系（r=0.51，n=31，p<0.05）[图4（B）]。当蓝藻生物量和藻蓝蛋白的荧光分别在其最高峰时（2002年8月13日），观察到了最高浓度的微囊藻毒素（约7 g微克/升）。然而在9月9日，当荧光和生物量水平低的时候，也观察到了高浓度的微囊藻毒素。微囊藻毒素总浓度高于3毫克/升的荧光值不包括在相关性分析内，因为它们的数量在统计上微不足道。蓝藻生物量和微囊藻毒素总浓度之间的相关系数比藻蓝蛋白荧光和微囊藻毒素之间的相关系数高[r=0.74，n=31，p<0.05；图4（C）]。
 

讨论

在饮用水处理中，一个早期预警系统能提供及时的原水水质信息，为水厂运作提供建议。在建立一个早期预警系统的第一步是选择检测器（Grayman等人，2001年）。要检测蓝藻，有效的选择性检测在混合浮游植物群落中的蓝藻是特别重要的。藻蓝蛋白是蓝藻的特性，荧光测量藻蓝蛋白是表示原水中蓝藻浓度的一个高度敏感的指标。在蓝藻生物量约为0.2毫克/升，相当于1113个细胞/毫升时，能够获得积极的荧光信号。按照WHO警戒级别框架，这检出限对应的阈值定义为警戒级别1（Bartram等人，1999年）。同时，当浮游植物群落以硅藻和绿藻为主时，即使总浮游植物生物量很高，藻蓝蛋白的荧光也是微乎其微的（图1）。这些结果表明，蓝藻监测从水华发展非常早期的阶段开始，并且可以清楚地分离浮游植物的其他组成部分所给予的信号。
Lee等人（1994年）发现，浓度在104-106细胞/毫升的范围内，蓝藻细胞数和藻蓝蛋白荧光呈线性关系。Ahn等人（2002年）发现，蓝藻细胞数量与藻蓝蛋白浓度的相关性比蓝藻细胞数量与叶绿素浓度的相关性要高。同样，该研究表明，藻蓝蛋白荧光和蓝藻生物量呈正相关关系。在相关性[图4（A） ]中，分散的点是由于每个蓝藻细胞中藻蓝蛋白浓度不同的差异而造成的。这可能是氮源或光线影响每个蓝藻细胞中藻蓝蛋白含量的结果。因为藻胆蛋白是氮储备，所以这就是为什么氮限制诱导藻蓝蛋白降解的原因（Rapala，1998年）。低光照强度可能会刺激合成藻蓝蛋白（Grossmanet等人，1994年）。
这项研究其他方面的调查是应用藻蓝蛋白荧光估计微囊藻毒素浓度。研究表明，藻蓝蛋白荧光强度和微囊藻毒素总浓度之间具有中等程度的相关性，低于蓝藻生物量和微囊藻毒素总浓度之间的相关性。许多作者表明，每个蓝藻细胞中的微囊藻毒素浓度不是常数，取决于温度和可用性营养盐等参数（Codd和Poon，1988年； Orr和Jones，1998年； Rapala，1998年； Long等人，2001年）。2002年8月13日记录的高密度微囊藻藻华爆发，观察到大量的细胞分解，导致水中出现非常高的可溶性微囊藻毒素浓度（图2）。在这种情况下，藻蓝蛋白被释放到水迅速降解。此外，该低相关性可能是由水库入水口有毒和无毒的蓝藻共存造成的。测量藻蓝蛋白荧光，可被视为一个水中蓝藻细胞浓度的指标，类似于既定的每毫升水中蓝藻细胞数目的指标。叶绿素a测量和总浮游植物生物量测量没有多少信息价值，因为这些措施包括了真核浮游植物。不过，荧光方法是不足之处是无法直接估计毒素的浓度。按照WHO警戒级别框架，表明蓝藻细胞丰度的同时，涉及到的第二个决定就是要求毒性的评估或毒素的检测。
随着检测频率的增加，早期预警系统的效率需要提高（Grayman等人，2001年）。较长时间的采样测样会拖延检测，并削减水处理厂作出正确行动的时间，也可能会导致遗漏了一些短暂事件。蓝藻赤潮的特点是高度动态的变化，在长时间内因季节性因素，或者在短时间内（几个小时）因为天气因素而变化。因此，优化水处理工艺应根据连续监测原水中的蓝藻细胞。测量藻蓝蛋白的荧光，提供快速的结果，而不必花费时间进行人工水样预处理。应用荧光流动模式证实了连续监测（每15分钟）藻蓝蛋白荧光强度的重要性（图3）。
藻蓝蛋白的荧光测量，也可用于检测作为饮用水水源的水库的水质。藻蓝蛋白的荧光测量，可以检测水库中蓝藻细胞的纵向和横向分布，优化深度饮用水的提取。水平分布的检测，可用于预测水库中蓝藻水华的产生和易位的潜在危险。

 

 

 

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